Metodi terapeutici e di laboratorio

La stimolazione ovarica minima è rivolta alle donne che non desiderano sottoporsi alla stimolazione convenzionale per la fecondazione in vitro. Per la stimolazione si utilizzano compresse di citrato di clomifene (Clostilbegyt o Letrozole) in combinazione con basse dosi dei farmaci iniettabili impiegati nei cicli convenzionali. La fecondazione degli ovociti viene eseguita mediante ICSI. La probabilità di gravidanza è inferiore rispetto alla fecondazione in vitro convenzionale, ma il rischio di OHSS (iperstimolazione) e i costi della stimolazione sono più bassi.

Nella pratica, la stimolazione minima viene utilizzata soprattutto nei seguenti casi:

1. Una stimolazione precedente è stata complicata da una sindrome da iperstimolazione ovarica.
2. La donna teme la stimolazione ormonale a dosi più elevate.
3. Nelle donne con sindrome dell’ovaio policistico (sindrome PCO).
4. In caso di ripetuti insuccessi del trattamento dell’infertilità con fecondazione in vitro convenzionale.
5. Quando è necessario ridurre al minimo i costi del trattamento.

Il primo tentativo riuscito di fecondazione artificiale risale al 1978, quando, grazie al dott. R. Edwards e al dott. P. Steptoe, nacque la prima bambina concepita mediante la tecnica IVF/ET: Louise Brown, in Gran Bretagna. Secondo le più recenti stime degli esperti, ogni anno nascono nel mondo circa 500.000–800.000 bambini grazie alla fecondazione in vitro e ad altri metodi di procreazione assistita. Le tecniche di procreazione assistita comprendono un insieme di procedure in cui ovociti e spermatozoi vengono manipolati al di fuori del corpo della donna.

Dopo una preparazione ormonale finalizzata alla maturazione di un maggior numero di ovociti, questi vengono prelevati per aspirazione direttamente dalle ovaie poco prima dell’ovulazione e trasferiti in un apposito terreno di coltura. Le successive procedure di laboratorio dipendono dal metodo di fecondazione scelto. Dopo la fecondazione, gli ovociti fecondati vengono coltivati in terreni specifici per due–sei giorni. Solitamente si trasferisce poi un solo embrione nell’utero della donna; gli altri embrioni di buona qualità possono essere congelati.

Preparazione alla fecondazione in vitro:

Stimolazione ormonale:

La crescita di più follicoli aumenta le possibilità di ottenere un maggior numero di ovociti di buona qualità e, di conseguenza, più embrioni idonei al trasferimento o al congelamento. Questo risultato viene raggiunto mediante una stimolazione ormonale sotto costante controllo medico.

Egg retrieval:

The egg retrieval is performed under short general anesthesia guided by trans-vaginal ultrasound and it takes about 5-10 minutes. The procedure is done with a special thin needle, which goes via vaginal whole straight to an ovary. From there are the eggs suctioned. The patient is discharged about 2 hours post procedure.

Prelievo degli ovociti:

Il prelievo degli ovociti viene eseguito in anestesia generale di breve durata, sotto guida ecografica transvaginale, e dura circa 5–10 minuti. Si utilizza un apposito ago sottile che, attraverso la parete vaginale, raggiunge direttamente l’ovaio, dal quale vengono aspirati gli ovociti. La paziente viene dimessa circa 2 ore dopo la procedura.

Raccolta e preparazione dello sperma:

Il partner fornisce un campione di sperma il giorno del prelievo degli ovociti, in una stanza dedicata. Per ottenere un campione della migliore qualità possibile, si raccomanda un’astinenza sessuale di 2–3 giorni prima della raccolta. Dopo la preparazione in laboratorio degli spermatozoi del partner con appositi metodi, ad esempio swim-up o chip microfluidico per la selezione spermatica, si procede alla fecondazione degli ovociti. La fecondazione avviene spontaneamente: lo spermatozoo si avvicina all’ovocita e ne attraversa l’involucro. La coltura congiunta di ovociti e spermatozoi dura 16–20 ore. Un secondo metodo, più diffuso, è l’ICSI, in cui l’embriologo inietta direttamente uno spermatozoo nell’ovocita con un ago sottile. L’ICSI presenta un tasso di fecondazione più elevato (80–90%). Circa 18 ore dopo la procedura ICSI/IVF, l’embriologo verifica l’avvenuta fecondazione, caratterizzata dalla presenza di due pronuclei e due globuli polari.

Se l’uomo teme di non riuscire a fornire il campione il giorno del prelievo degli ovociti, può ricorrere preventivamente alla crioconservazione.

Per gli uomini che non hanno spermatozoi nell’eiaculato, MESA/TESE è una delle possibilità per ottenere spermatozoi da utilizzare nel ciclo di fecondazione in vitro.

Coltura embrionale:

Gli embrioni vengono coltivati in terreni specifici per 2–6 giorni. Successivamente vengono trasferiti nell’utero. Gli embrioni in eccesso possono essere congelati e conservati per un eventuale utilizzo futuro.

È la procedura con cui gli embrioni vengono introdotti nella cavità uterina mediante un apposito catetere sottile, insieme a un piccolo volume di terreno di coltura. La procedura è rapida, nella maggior parte dei casi indolore e non richiede anestesia generale. Il numero di embrioni trasferiti dipende soprattutto dall’età della paziente, dal numero di precedenti cicli di fecondazione in vitro senza successo e dalle preferenze della paziente. Nella maggior parte dei casi si trasferisce 1 embrione. La paziente lascia la clinica circa 1 ora dopo il trasferimento. Il test di gravidanza viene eseguito dopo 2 settimane.

Coltura fino allo stadio di blastocisti

L’utilizzo di appositi terreni consente di prolungare la coltura embrionale fino a 5 o 6 giorni, raggiungendo lo stadio di blastocisti o di blastocisti espansa. Il vantaggio è la possibilità di scegliere gli embrioni di migliore qualità per il trasferimento e aumentare le probabilità di gravidanza. La coltura prolungata è particolarmente indicata quando è disponibile un numero sufficiente di ovociti maturi (6 o più). La scelta del momento ottimale per il trasferimento embrionale è molto individuale e può variare nei cicli successivi.

È una tecnica aggiuntiva che prevede l’apertura mediante laser di un foro nell’involucro, detto zona pellucida, di un embrione di 2–4 giorni. L’embrione utilizza poi questa apertura per fuoriuscire dall’involucro. La tecnica è consigliata per embrioni con un involucro più spesso oppure in caso di ripetuti fallimenti dell’impianto, quando nei cicli precedenti l’embrione non si è impiantato spontaneamente.

Il congelamento degli embrioni consente di conservare quelli di buona qualità in eccesso per il tempo necessario, fino a un massimo di 25 anni. Vengono conservati in azoto liquido, pronti per un trasferimento successivo. La crioconservazione viene utilizzata quando rimangono embrioni di buona qualità non trasferiti nel ciclo, ad esempio per il rischio di una gravidanza multipla. In caso di sindrome da iperstimolazione ovarica grave o di condizioni non adatte al trasferimento, come un’altra malattia della paziente o un endometrio troppo sottile, vengono congelati tutti gli embrioni. Nonostante la standardizzazione della procedura, l’1–2% degli embrioni non sopravvive allo scongelamento in condizioni idonee al trasferimento.

Il tasso di successo del trasferimento di embrioni congelati e successivamente scongelati è inferiore rispetto a quello degli embrioni freschi. Per la donna, questa opzione è più comoda perché non richiede di ripetere la terapia ormonale e il prelievo degli ovociti. Sulla base delle conoscenze attuali, non è noto un aumento del rischio di anomalie o malformazioni congenite causato da questo metodo.

Il test genetico preimpianto, PGT (PGT-A, PGT-SR, PGT-M), è un metodo diagnostico che, nell’ambito di un ciclo di fecondazione in vitro, permette di analizzare alcune caratteristiche genetiche degli embrioni prima del loro trasferimento nell’utero. Da un embrione di 5 o 6 giorni vengono prelevate delicatamente 5–10 cellule, che vengono sottoposte ad analisi genetica. Gli embrioni vengono congelati il giorno del prelievo delle cellule. Un embrione con un risultato genetico normale viene successivamente preparato per il trasferimento di un embrione congelato (KET). Generalmente, gli embrioni sopravvivono a questa procedura senza danni.

Il test genetico preimpianto per le aneuploidie (PGT-A) consente di rilevare in particolare variazioni acquisite o ereditarie del numero o della struttura dei cromosomi. Queste anomalie sono spesso associate ad aborti spontanei.

Il test genetico preimpianto per le malattie monogeniche (PGT-M) può rilevare alterazioni, o mutazioni, di singoli geni associate a una specifica malattia ereditaria già presente nella famiglia.

La PGT è consigliata soprattutto alle coppie in cui:

• La donna ha più di 35 anni, con un aumento della probabilità di avere un bambino con un numero anomalo di cromosomi, ad esempio la sindrome di Down.
• Si è già verificato un aborto spontaneo o la nascita di un feto con un’anomalia cromosomica.
• Si verificano ripetuti insuccessi della fecondazione in vitro o aborti spontanei ricorrenti nelle prime fasi della gravidanza.
• In uno dei partner è stato rilevato citogeneticamente un riarrangiamento cromosomico. Anche se la persona non presenta manifestazioni evidenti, il riarrangiamento può determinare la formazione di cellule germinali, ovociti o spermatozoi, con un patrimonio genetico anomalo e la trasmissione del difetto alla prole.
• Nella famiglia è presente una malattia legata al sesso, che colpisce solo gli individui maschi ma viene trasmessa geneticamente dalle donne, ad esempio l’emofilia.

Uno dei partner ha seguito o sta seguendo un trattamento chemioterapico o radioterapico.

Il test genetico preimpianto non può garantire completamente la selezione di un embrione privo di qualsiasi difetto. Il metodo consente infatti di esaminare solo uno specifico insieme di anomalie a cui sono maggiormente esposti gli embrioni della coppia. Non può neppure garantire il successo del programma di fecondazione in vitro, cioè l’impianto dell’embrione dopo il trasferimento nell’utero e l’inizio della gravidanza, né la nascita di un bambino sano. Tutti questi risultati dipendono da numerosi altri fattori.

Test diagnostico molecolare per la valutazione della recettività endometriale, cioè dello stato della mucosa uterina.

La recettività endometriale è la condizione in cui l’endometrio, ossia la mucosa uterina, è pronto per l’impianto dell’embrione. In ogni donna fertile, questa condizione ottimale dovrebbe verificarsi tra il 17° e il 21° giorno.

The endometrium is usually assessed by ultrasound examination, which shows its height and structure. The ERA test offers wider possibilities for assessing the endometrium, thereby increasing the likelihood of successful pregnancy.

L’endometrio viene generalmente valutato mediante ecografia, che ne mostra lo spessore e la struttura. Il test ERA offre maggiori possibilità di valutazione, aumentando così la probabilità di una gravidanza riuscita.

L’esame è indicato per le donne con ripetuti fallimenti dell’impianto embrionale.

Il test analizza 248 geni coinvolti nella recettività endometriale. Il momento più adatto per eseguirlo è il ciclo precedente a quello in cui è previsto il trasferimento embrionale.

Il medico può valutare se l’endometrio è adeguatamente recettivo al trasferimento nei giorni previsti oppure se la cosiddetta «finestra di impianto» si è spostata.

Una rivoluzione nel trattamento dell’infertilità maschile è arrivata nel 1992, con l’annuncio delle prime gravidanze ottenute iniettando un singolo spermatozoo nell’ovocita attraverso il suo involucro, la zona pellucida. Questo metodo aiuta innumerevoli coppie per le quali, fino a pochi anni prima, non c’erano alternative all’utilizzo di spermatozoi di un donatore.

L’iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI) è una sofisticata tecnica di micromanipolazione: lo spermatozoo viene aspirato in un sottile capillare di vetro appuntito e introdotto nell’ovocita attraverso il suo involucro.

L’ICSI è indicata quando gli spermatozoi non sono in grado di fecondare spontaneamente l’ovocita, per esempio a causa di un basso numero o di una ridotta motilità, in presenza di cause immunologiche di infertilità o dopo insuccessi della fecondazione in vitro convenzionale. È consigliata anche dopo ripetuti tentativi di inseminazione artificiale senza successo, in caso di età più avanzata della paziente, di un basso numero di ovociti maturi, di utilizzo di sperma crioconservato o ottenuto con MESA/TESE, di impiego di ovociti donati e in altre situazioni. Il metodo presenta un tasso di fecondazione molto elevato. La paziente deve comunque sottoporsi alla consueta stimolazione per la superovulazione e al prelievo degli ovociti, mentre il partner deve fornire il campione di sperma. In base ai dati raccolti, la fecondazione con questo metodo non aumenta il rischio di malformazioni congenite rispetto al concepimento spontaneo (2,3%).

È una tecnica di laboratorio, una versione evoluta dell’ICSI, che consente di selezionare e introdurre nell’ovocita un singolo spermatozoo maturo. Questo aumenta il successo del trattamento dell’infertilità. In natura, solo gli spermatozoi maturi in grado di legarsi specificamente al complesso ovocitario, attraverso l’ialuronano, possono fecondare l’ovocita. Negli spermatozoi maturi è stata dimostrata una frequenza molto inferiore di aberrazioni cromosomiche rispetto a quelli immaturi.

Nell’ICSI convenzionale, lo spermatozoo viene selezionato in base alla morfologia e alla motilità. Questo non garantisce la scelta di uno spermatozoo con un patrimonio genetico ottimale. La PICSI combina i vantaggi dell’ICSI, cioè un’elevata probabilità di fecondazione, con la possibilità di selezionare spermatozoi maturi in base alla capacità di legarsi a un idrogel di ialuronano. La PICSI riproduce il legame dello spermatozoo maturo con il complesso ovocitario, un passaggio importante per la selezione dello spermatozoo nella fecondazione naturale. La tecnica può essere utilizzata solo se nell’eiaculato è presente un numero sufficiente di spermatozoi con buona motilità.

Utilizzando un terreno per il trasferimento con un elevato contenuto di ialuronano, la Clinica di medicina riproduttiva e ginecologia Zlín offre una procedura moderna che aumenta le possibilità di concepire un figlio.

Il terreno viene utilizzato per trasferire gli embrioni nell’utero. Contiene tutti i nutrienti e le fonti di energia necessari per uno sviluppo embrionale ottimale. Presenta inoltre una maggiore concentrazione di ialuronano, naturalmente presente nei liquidi follicolari, tubarici e uterini, dei quali aumenta la viscosità.

Il terreno può essere utilizzato per il trasferimento di embrioni a qualsiasi stadio di sviluppo, dagli embrioni di due giorni alle blastocisti, sia freschi sia congelati.

MESA significa aspirazione microchirurgica degli spermatozoi dall’epididimo. La procedura viene eseguita quando il trasporto degli spermatozoi tra l’epididimo e l’uretra è compromesso. Nella maggior parte dei casi si tratta di un intervento chirurgico a cielo aperto in anestesia generale. Attraverso un’incisione di circa 3 cm nello scroto si accede all’epididimo e si aspira il liquido direttamente dai tubuli mediante una pipetta. Il liquido viene analizzato durante l’intervento nel laboratorio di embriologia. Se contiene spermatozoi vivi, questi vengono utilizzati per la fecondazione degli ovociti mediante ICSI.

Se con la MESA non si ottengono spermatozoi, si procede alla TESE. Questa procedura consente di recuperare spermatozoi dal tessuto testicolare quando non riescono a passare dal testicolo all’epididimo.

Attraverso piccole incisioni nell’involucro del testicolo si preleva una porzione di tessuto, che viene elaborata in laboratorio. Se sono presenti spermatozoi vivi, vengono utilizzati per la fecondazione. In caso di azoospermia, cioè assenza di spermatozoi vivi, confermata ripetutamente, questi metodi non garantiscono il recupero di spermatozoi idonei. Il paziente viene informato dell’esito subito dopo la procedura.

La Clinica di medicina riproduttiva e ginecologia Zlín offre ai pazienti un metodo moderno di coltura embrionale in incubatore, con monitoraggio continuo degli embrioni mediante una telecamera. EmbryoScope è un sistema unico che riunisce in un solo dispositivo un incubatore, un software diagnostico con intelligenza artificiale, un microscopio e un sistema di telecamere. Questo incubatore permette di creare le condizioni ideali per la crescita degli embrioni, che controlla, valuta e registra. Gli embriologi possono quindi monitorare costantemente l’ambiente in cui si trovano gli embrioni. La selezione embrionale è supportata dall’intelligenza artificiale integrata nel modulo di valutazione di EmbryoScope.

Infusione di Intralipid 20%

La ricerca ha dimostrato che le perdite precoci di gravidanza, come gli aborti spontanei e gli aborti ritenuti, e i fallimenti dell’impianto embrionale, che si manifestano come infertilità o ripetuti insuccessi della procreazione assistita, possono essere causati da un’attività eccessiva delle cellule NK («Natural Killer»). Le cellule NK sono una specifica popolazione di globuli bianchi che contribuisce alle difese dell’organismo; nella forma attiva possono però attaccare un embrione che si impianta nella cavità uterina e indebolirlo fino a provocarne la perdita. È stato dimostrato che la somministrazione precoce di Intralipid può prevenire l’attivazione delle cellule NK. Senza tale attivazione, le cellule NK non rappresentano un pericolo per l’embrione.

Metodo di selezione degli spermatozoi basato sull’attivazione magnetica degli spermatozoi apoptotici: sistema MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting).

Tutti gli spermatozoi hanno una durata di vita limitata e vengono eliminati attraverso un processo chiamato apoptosi. Negli spermatozoi in cui questo processo è già iniziato, è molto probabile la presenza di frammentazione del DNA, cioè di rotture. Queste rotture non possono purtroppo essere rilevate al microscopio con le tecniche ICSI e PICSI. Se uno spermatozoo apoptotico viene utilizzato per fecondare un ovocita, aumenta la probabilità che l’embrione ottenuto non si sviluppi in modo ottimale o interrompa completamente il proprio sviluppo.

Con la MACS possiamo marcare magneticamente gli spermatozoi apoptotici: quando il campione attraversa una speciale colonna, questi rimangono trattenuti al suo interno, mentre quelli senza segni di apoptosi vengono raccolti al di sotto della colonna. Questi spermatozoi «vivi», senza segni di frammentazione del DNA, possono poi essere utilizzati per altri trattamenti: IUI, IVF, ICSI e PICSI.

Questo metodo di laboratorio utilizza uno speciale chip in vetro con microbarriere, che seleziona gli spermatozoi secondo il principio della selezione naturale.

Le microbarriere riproducono l’ambiente naturale delle tube di Falloppio della donna.

Gli spermatozoi selezionati presentano una migliore morfologia, vitalità e motilità.

L’intero processo avviene senza l’aggiunta di ulteriori reagenti e aumenta significativamente il tasso di successo del ciclo.

La terapia PRP (Platelet-Rich Plasma, plasma ricco di piastrine) è un metodo innovativo e delicato che utilizza plasma ottenuto dal proprio sangue. Dopo la preparazione, il plasma contiene una maggiore concentrazione di piastrine e numerosi fattori di crescita che favoriscono la rigenerazione dell’organismo.

Il principale beneficio della terapia PRP è favorire la crescita dell’endometrio e migliorare la preparazione dell’utero all’impianto embrionale, poiché la qualità della mucosa è essenziale per il successo della fecondazione assistita.

Se l’endometrio non raggiunge i parametri necessari, le possibilità di impianto dell’embrione diminuiscono e aumenta il rischio di aborto spontaneo e di altre complicanze.

Un grande vantaggio del metodo è anche la sicurezza: si utilizzano cellule che l’organismo conosce, quindi non occorre temere reazioni avverse.

COME FUNZIONA IL PRP?

Prelievo del sangue: si preleva innanzitutto sangue da una vena del gomito, che viene poi elaborato in un dispositivo specifico.

Preparazione del PRP: dal sangue viene separato plasma ricco di piastrine, con un’elevata concentrazione di fattori di crescita che favoriscono la rigenerazione dei tessuti.

Applicazione: il PRP viene introdotto nella cavità uterina mediante un sottile catetere. La procedura ne favorisce la rigenerazione.

A CHI È INDICATO IL METODO?

Consigliamo questo metodo alle donne che hanno bisogno di migliorare la qualità dell’endometrio, ad esempio prima del trasferimento embrionale.

Vantaggi del PRP

• Una procedura sicura che non richiede interventi invasivi.

• Contribuisce ad aumentare le possibilità di gravidanza.

• L’utilizzo del proprio materiale biologico riduce al minimo il rischio di reazioni allergiche.

• Favorisce la crescita e la qualità dell’endometrio.

COME SI SVOLGE IL TRATTAMENTO?

• Ciclo di fecondazione in vitro: l’applicazione del PRP è indicata all’inizio di un ciclo convenzionale di fecondazione in vitro o di KET e, in alcuni casi, anche prima del trasferimento embrionale.

• Consulenza: il medico valuta la situazione e propone un piano di trattamento personalizzato.

• Applicazione del PRP: la procedura è rapida, indolore e dura generalmente meno di 1 ora.

La maturità dell’ovocita è un requisito essenziale per la sua fecondazione.

La maturità degli ovociti viene normalmente valutata dall’embriologo mediante un microscopio ottico. Un ovocita in cui è presente il cosiddetto globulo polare viene considerato maturo.

Tuttavia, anche un ovocita di questo tipo potrebbe non essere realmente maturo. È importante la presenza del fuso meiotico, necessario per la corretta divisione dei cromosomi dopo la fecondazione. Oggi possiamo rilevarlo in modo non invasivo mediante una nuova tecnica di visualizzazione, la microscopia a luce polarizzata, e fecondare mediante ICSI/PICSI ovociti effettivamente maturi.

Questo metodo è indicato per le pazienti con un numero ridotto di ovociti ottenuti e per quelle in cui la fecondazione non è riuscita nei precedenti cicli di fecondazione in vitro.

Terreno destinato al trasferimento di embrioni congelati, o criotrasferimento embrionale.

Contiene sostanze, tra cui il GM-CSF (fattore stimolante le colonie di granulociti e macrofagi), che favoriscono la vitalità dell’embrione, lo proteggono dallo stress ossidativo e ne migliorano la capacità di aderire all’utero.

Il KET, o criotrasferimento embrionale, consiste nel trasferimento di un embrione scongelato nella cavità uterina. Si utilizza per embrioni congelati dopo un precedente ciclo di fecondazione in vitro con ovociti propri o donati, ad esempio per la presenza di embrioni di buona qualità in eccesso, per il test genetico PGT o per rinviare il trasferimento a un momento più adatto.

Il vantaggio per la donna è che non sono necessari una nuova stimolazione ormonale e un nuovo prelievo degli ovociti; non occorre neppure sincronizzare il ciclo mestruale della donatrice con quello della ricevente. Prima del trasferimento, l’endometrio viene preparato con ormoni, estrogeni e progesterone, per renderlo il più adatto possibile all’impianto dell’embrione.

L’embrione viene scongelato il giorno del trasferimento e l’embriologo ne valuta la qualità e la capacità di continuare a svilupparsi. Viene poi trasferito nell’utero mediante un apposito catetere sottile. La procedura è breve, generalmente indolore, viene eseguita in regime ambulatoriale e non richiede anestesia. Il test di gravidanza viene effettuato circa 2 settimane dopo il trasferimento.

Il tasso di successo del KET è paragonabile a quello del trasferimento di embrioni freschi. Le conoscenze attuali non dimostrano un aumento del rischio di malformazioni congenite dopo la crioconservazione degli embrioni.